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組織培養(yǎng)中的清洗、消毒滅菌技術(shù)
1、清洗植物組織培養(yǎng)用的各種玻璃器皿，特別是培養(yǎng)瓶和盛培養(yǎng)基的器皿，一定要嚴格清洗，以防油污、重金屬離子、酸、堿等有害物質(zhì)殘留在瓶內(nèi)，影響培養(yǎng)物的生長。使用過的玻璃器皿應(yīng)及時清洗，先將污物如培養(yǎng)基、培養(yǎng)物倒掉，再浸入水中，然后洗滌。玻璃器皿的洗滌，可根據(jù)器皿的污染程度和性質(zhì)，采用不同的方法，通常有堿洗法和酸洗法。凡有微生物污染的器皿，必須先進行高壓消毒和煮沸，以殺死菌體，否則會產(chǎn)生孢子飛揚，污染環(huán)境，給組織培養(yǎng)帶來嚴重困難。器皿洗凈后，應(yīng)烘干或晾干，放在規(guī)定的地方，便于取用。 常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類，即：物理方法如干熱(烘燒和灼燒)、濕熱(常壓或高壓蒸煮)、射線處理(紫外線、超聲波、微波)、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學(xué)方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理。這些方法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適當(dāng)選用濕熱滅菌（培養(yǎng)基）培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在o．1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達121℃。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。注意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到O．05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。三次放氣后，關(guān)閥再通電，壓力表上升達0．1-0．15Mpa時，維持15-20min。o對高壓滅菌后不變質(zhì)的物品，如無菌水、栽培介質(zhì)、接種用具，可以延長滅菌時間或提高壓力。而培養(yǎng)基要嚴格遵守保壓時間，既要保壓徹底，又要防止培養(yǎng)基中的成分變質(zhì)或效力降低，不能隨意延長時間。對于一些布制品，如實驗服、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅菌20-30min。高壓滅菌前后的培養(yǎng)基，其pH值下降0.2-0.3單位。高壓后培養(yǎng)基pH值的變化方向和幅度取決于多種因素。在高壓滅菌前用堿調(diào)高pH值至預(yù)定值的則相反。培養(yǎng)基中成分單一時和培養(yǎng)基中含有高或較高濃度物質(zhì)時，高壓滅菌后的pH值變化幅度較大，甚至可大于2個pH值單位。環(huán)境pH值的變化大于0.5單位就有可能產(chǎn)生明顯的生理影響。高壓滅菌通常會使培養(yǎng)基中的蔗糖水解為單糖，從而改變培養(yǎng)基的滲透壓。在8%-20%蔗糖范圍內(nèi)，高壓滅菌后的培養(yǎng)基約升高0．43倍。培養(yǎng)基中的鐵在高壓滅菌時會催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養(yǎng)基值小于5.5，其水解量更多，培養(yǎng)基中添加0.1%活性炭時，高壓下蔗糖水解大大增強，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達5%。 灼燒滅菌（用于無菌操作的器械）o在無菌操作時，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精燈火焰卜灼燒火菌。冷卻后，立即使用。操作中可采用250或500ml的廣口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。 干熱滅菌（玻璃器皿及耐熱用具）干熱滅菌是利用烘箱加熱到160-180~C的溫度來殺死微生物。由于在干熱條件下，細菌的營養(yǎng)細胞的抗熱性大為提高，接近芽抱的抗熱水平，通常采用170℃持續(xù)90min來滅菌。干熱滅菌的物品要預(yù)先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎，以免滅菌后取用時重新污染。包扎可用耐高溫的塑料。滅菌時應(yīng)漸進升溫，達到頂定溫度后記錄時間。烘箱內(nèi)放置的物品的數(shù)量不宜過多，以免妨礙熱對流和穿透，到指定時間斷電后，待充分冷涼，才能打開烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。干熱滅菌能源消耗太大，浪費時間。 過濾滅菌（不耐熱的物質(zhì)）一些生長調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法。可用無菌的孔徑0.20-0.45um的硝酸纖維素膜過濾菌類，當(dāng)溶液通過濾膜后，細菌的細胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻，在需要過濾滅菌的液體量大時，常使用抽濾裝置；液量小時，可用注射器。使用前對其高壓滅菌，將濾膜裝在注射器的靠針管處，將待過濾的液體裝入注射器，推壓注射器活塞桿，溶液壓出濾膜，從針管壓出的溶液就是無菌溶液。 紫外線和熏蒸滅菌（空間）o(1)紫外線滅菌在接種室、超凈臺上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌，細菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，引起細菌的染色體變異，造成死亡。紫外線的波長為200-300nm，其中以260nm的殺菌能力最強，但是由于紫外線的穿透物質(zhì)的能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌，而且要求距照射物以不超過1.2m為宜。 (2)熏蒸滅菌用加熱焚燒、氧化等方法，使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。這種方法簡便，只需要把消毒的空間關(guān)閉緊密即可。常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時，房間關(guān)閉緊密，按5-8ml／m3用量，將甲醛置于廣口容器中，加5g/m3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時，房間可預(yù)先噴濕以加強效果。冰醋酸也可進行加熱熏蒸，但效果不如甲醛。化學(xué)消毒劑的種類很多，它們使微生物的蛋白質(zhì)變性，或競爭其酶系統(tǒng)，或降低其表面張力，增加菌體細胞漿膜的通透性，使細胞破裂或溶解。一般說來，溫度越高，作用時間越長，殺菌效果越好。另外，由于消毒劑必須溶解于水才能發(fā)揮作用，所以要制成水溶狀態(tài)，如升汞與高錳酸鉀。還有消毒劑的濃度一般是濃度越大，殺菌能力越強，但石炭酸和酒精例外。 噴霧滅菌（物體表面）物體表面可用一些藥劑涂擦、噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面等，可用70%的酒精反復(fù)涂擦滅菌，l%-2%的來蘇兒溶液以及0.25%-1%的新潔爾滅也可以。 3、無菌操作 植物組織培養(yǎng)是一種無菌技術(shù)，因此不僅要求整個操作過程，一切用具、材料、培養(yǎng)基、培養(yǎng)室、工作人員的衣物都要無菌，而且要求工作人員在操作過程中要遵守?zé)o菌操作的規(guī)程，如少有疏忽，都會造成無法挽回的后果，使工作前功盡棄。工作人員在進行無菌操作是要嚴守以下幾點： a.入無菌室前，要洗手，去掉指甲中的污物。 b.入室時要穿上經(jīng)過消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。 c.操作前要用70的酒精擦洗工作人員的手，操作中要經(jīng)常用酒精擦洗手。不準講話，亦不準對著操作區(qū)呼吸，以免微生物污染材料、培養(yǎng)基和用具。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。 d.必須在酒精燈火焰處進行操作，如打開瓶口，轉(zhuǎn)接材料。蓋瓶蓋前應(yīng)將瓶口在火焰上燒一下，再將蓋子也在火焰上燒一下，然后蓋上。
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